Сульфатированные полисахариды эффективно ингибируют SARS-CoV-2 in vitro

Sulfated polysaccharides effectively inhibit SARS-CoV-2 in vitro
Paul S. Kwon1,2, Hanseul Oh3, Seok-Joon Kwon1, Weihua Jin1,4, Fuming Zhang1, Keith Fraser5, Jung Joo Hong 3,
Robert J. Linhardt 1,2,5 and Jonathan S. Dordick 1,5

Сульфатированные полисахариды эффективно ингибируют SARS-CoV-2 in vitro

Дорогой читатель,
COVID-19, вызванный вирусом SARS-CoV-2, в настоящее время распространился по всему миру с катастрофическими человеческими и экономическими последствиями и в настоящее время заразил более 10 миллионов человек и убил более 500000 человек1. В целях смягчения симптомов заболевания и предотвращения распространения вируса стремительными темпами предпринимаются усилия по разработке вакцин и поиску лекарств2. Недавно мы показали, что хорошо известный антикоагулянт гепарин обладает исключительной аффинностью связывания со спайковым белком (S-белком) SARS-CoV-23. S-белок SARS-CoV-2 более плотно связывается с иммобилизованным гепарином (K = ~ 10-11DM), чем S-белки SARS-CoV (K = ~ 10-7M) или MERS-CoV (KD = ~ 10-9 М). Однако не известно, трансформируется ли прочное связывание гепарина с S-белком SARS-CoV-2 в мощную противовирусную активность. В текущем исследовании мы оценили противовирусные свойства гепарина и других близкородственных полисахаридов in vitro для оценки релевантности гепарин-связанных ГАГ и других сульфатированных полисахаридов как части фармакопеи потенциальных терапевтических средств, нацеленных на SARS-CoV- 2. Vero-CCL81, который экспрессирует как ACE2, так и TMPRSS24, использовали для репликации вируса с высоким титром5 для использования в противовирусных анализах.
Гепарин, гепарансульфаты, другие гликозаминогликаны (ГАГ) 3, фукоидан и другие высокосульфатированные полисахариды были проверены с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) для измерения аффинности связывания с S-белком SARS-CoV-2 (рис. 1а). Вкратце, исследования конкуренции растворов между иммобилизованным на поверхности гепарином и другими сульфатированными полисахаридами оценивали путем инъекции одного S-белка SARS-CoV-2 (50 нМ) или в смеси с 1 мкМ указанного полисахарида в буфере SPR при скорости потока 30 мкл / мин. После каждого прогона проводили диссоциацию и регенерацию. Для каждой серии конкурентных экспериментов проводили контрольный эксперимент (S-белок без полисахарида), чтобы гарантировать полную регенерацию поверхности. Среди испытанных полисахаридов, RPI-27 и RPI-28, сложные сульфатированные полисахариды (фукоиданы), экстрагированные из морских водорослей Saccharina japonica6, химио-ферментативный синтез трисульфатированного (TriS) гепарина7 и нефракционированный USP-гепарин сам по себе были способны конкурировать с гепарином за S -белковое связывание. Мы выбрали эти соединения вместе с неантикоагулянтным низкомолекулярным гепарином (NACH) 8 для дальнейшего изучения (рис. 1b). Другие ГАГ, включая гепарансульфат, хондроитинсульфаты и кератансульфат, не демонстрируют конкурентного связывания по сравнению с контролем.
Для количественной оценки потенциальной цитотоксичности и противовирусной активности были выполнены стандартные анализы. Определение цитотоксичности полисахаридов проводили с использованием клеток Vero и стандартного анализа водорастворимой соли тетразолия-1 (WST-1) (Takara Bio Inc., Япония). Ни один из испытанных полисахаридов не проявил токсичности даже при самых высоких испытанных концентрациях. Клетки Vero были инфицированы SARS-CoV-2 с множественностью инфицирования (MOI) 2,5 × 10-3 с различными дозами полисахарида для подтверждения противовирусной активности. Анализ уменьшения фокуса был выполнен через 48 часов после заражения для определения эффективности. Противовирусная активность коррелировала с результатами SPR. Наиболее сильнодействующее испытанное соединение, RPI-27, представляет собой высокомолекулярный разветвленный полисахарид, родственный известному соединению фукоидану, и имеет EC50 8,3 ± 4,6 мкг / мл, что соответствует ~ 83 нМ (рис. 1c, d и Дополнительная таблица S1). Он значительно более эффективен, чем ремдесивир, у которого зарегистрированное значение EC50 in vitro составляет 770 нМ в клетках Vero- E69 и 11,4 мкМ в клетках Vero-CCL8110, который в настоящее время одобрен для экстренного применения при тяжелых инфекциях COVID-19. RPI-28 меньшего размера имеет ту же базовую структуру, что и RPI-27, но с более низкой молекулярной массой и, следовательно, более низкой активностью (EC50 = 1,2 мкМ, дополнительная таблица S1). Гепарин и TriS-гепарин (промежуточное соединение в биоинженерном пути синтеза гепарина3) также обладают мощной противовирусной активностью со значениями EC50 ~ 2,1 и 5 мкМ, в то время как NACH с более низкой молекулярной массой имеет прибл. EC50 55 мкМ. Подобная противовирусная активность гепарина также была недавно продемонстрирована11. Гепарин и TriS-гепарин подобны, причем последний лишен относительно небольшой фракции 3-O-сульфатных групп, присутствующих в гепарине (рис. 1b). Таким образом, ожидается их аналогичная активность. Однако низкомолекулярный NACH имел гораздо более низкие противовирусные свойства.
Высокая активность RPI-27 и RPI-28 по сравнению с другими испытанными полисахаридами может быть результатом поливалентных взаимодействий между полисахаридом и вирусной частицей12. В то время как гепарин, TriS-гепарин и NACH являются линейными полисахаридами, RPI-27 и RPI-28 оба сильно разветвлены (рис. 1b), что, возможно, дает дополнительные точки взаимодействия в трехмерном пространстве. Более высокое сродство RPI-27 по сравнению с RPI-28 и, следовательно, его более сильная противовирусная активность, может быть связано с гораздо более высокой молекулярной массой первого, что обеспечивает большую возможность для многоточечного связывания с S-белком SARS-CoV-2. . Неантикоагулянтный TriS-гепарин может быть более желательным для некоторых применений, чем мощный антикоагулянтный гепарин.
Наши результаты показывают, что специфические сульфатированные полисахариды прочно связываются с S-белком SARS-CoV-2 in vitro, что позволяет предположить, что они могут действовать как приманки, препятствуя связыванию S-белка с корецептором гепарансульфата в тканях хозяина3,11, подавляя вирусную инфекцию. Чтобы смоделировать это, мы построили модель стыковки между гепарином и сайтом связывания рецептора S-белка (RBD), используя кристаллическую структуру химерного комплекса RBD-ACE2 (PDB ID: 6VW1)13 (рис. 1e и подробно описанная модель стыковки). в дополнительной информации). Аминокислотные остатки RBD, участвующие в связывании рецептора ACE2 (ангиотензин-превращающий фермент 2), также участвовали в связывании гепарина, что указывает на механизм ингибирования проникновения вируса гепарином. Более того, чем крупнее модель олигосахарида, используемая в исследованиях докинга, тем прочнее связывание. В частности, октасахарид связывается прочнее, чем тетрасахарид (–7,3 против –6,1 ккал / моль).
Поскольку эти полисахариды демонстрируют многообещающую противовирусную активность in vitro и низкую цитотоксичность, мы предполагаем, что они могут иметь многообещающее клиническое применение. В соответствии с этим было обнаружено, что SARS-CoV-2 поражает широкий спектр тканей, обладающих достаточным уровнем ACE214, включая нос и желудочно-кишечный тракт15. Возможные пути доставки этих кандидатов в полисахариды, не являющиеся антикоагулянтами, включая фукоиданы (RPI-27 и RPI-28) и TriS-гепарин, могут осуществляться через назальный спрей, дозирующий ингалятор или пероральную доставку. Это отличается от ремдесивира, который необходимо вводить внутривенно16. Действительно, при пероральном приеме фукоиданы, выделенные из пищевых сульфатированных полисахаридов морских водорослей, считаются «общепризнанными безопасными», а гепарин, одобренный препарат, не является биодоступным при пероральном приеме. Интересно, что ретроспективное клиническое исследование показывает, что прием антикоагулянтов, таких как гепарин, может обеспечить лучшие результаты для пациентов, госпитализированных с COVID-19, включая резкое снижение смертности интубированных пациентов17. Неизвестно, является ли это результатом только антикоагуляции гепарина или в некоторой степени является эффектом его активности против SARS-CoV-2. Вдыхаемый гепарин имеет дополнительные преимущества, такие как уменьшение легочной коагулопатии и воспаления, не вызывая системного кровотечения18. С этой целью мы предлагаем, чтобы лечение фукоиданами, небулайзированным гепарином или, возможно, TriS-гепарином в сочетании с современными противовирусными препаратами или без них, следует оценивать сначала на первичных эпителиальных клетках человека, а затем на пациентах, страдающих COVID-19.